禽流感病毒與特定細菌的協同作用


禽流感病毒與特定細菌的協同作用

楊德威（1） 劉福安（2） 陳博文（3）

（1）中山大學生命科學學院生物防治國家重點實驗室生物醫藥中心

（2）華南農業大學醫學院

（3）四川出入境檢驗檢疫局

摘要： 本文主要以1997年至2003年期間，在香港爆發禽流感病毒感染引起大量家禽死亡的案例作分子病毒學與微生物學研究，發現某些禽流感病毒株能與細菌生長過程中所產生的分泌物產生協同作用，使原本不致病的禽流感弱病毒表現為致病致死的強病毒。

關鍵字 禽流感病毒（AIV）病毒協同作用 抗生素多抗性細菌
分類號 S858.292.01

流感病毒是屬於正粘病毒科的八節段的單鏈 RNA 病毒。基因組的每個節段能編碼一種蛋白，其中有的是功能蛋白，有的結構蛋白。結構蛋白中有核衣殼蛋白(NP)、基質蛋白(M)、血凝素(HA)和神經氨酸?(NA)。根據核衣殼蛋白和基質蛋白的抗原性，可以將流感病毒分類為A、B、C血清型。三個型可感染人類，而一般只有A型除了人類外還可以感染其他哺乳動物與禽類。 A型流感病毒可以進一步根據血凝素和神經氨酸?這兩個突出於病毒表面的纖突抗原細分為許多亞型，即H1、H2、H3 . . . . . . .H17包括人的H亞型（H1、H2、H3及1997年在香港發現的H5），和11個以上的神經氨酸?亞型，即N1、N2、N3 . . . . . . .N11。由於 H 和 N 亞型的不同組合，理論上可以出現 17 x 11 即 187以上的亞型，但實際上已鑒定的亞型數沒有那麼多。從總體上來說，所有的流感病毒 A型的 H 和N亞型都曾從禽類分離過，但對每一種禽種並不是那樣。一般認為雁形目(鴨、鵝等)感染流感病毒的亞型範圍較廣。發生於禽的流感病毒感染叫做禽流感，同樣也有豬流感，馬流感等。過去描述流感病毒的 H 和 N 亞型，習慣上用所分離的動物來命名，例如， Hav2Neq2，即 H 禽2 和 N 馬2亞型。後來，由於發現這些亞型可以交叉發生於各種畜禽，故 1978 年起採用不標明動物來源的統一命名方法。這樣，原來的 Hav2Neq2 就變為 H10 N8。

雞暴發高致病性禽流感首次報導於1878年(義大利)，當時稱為雞瘟。1955年才證明其病原為一種流感病毒，含有A型流感病毒的核蛋白。為了區別於後來首次發現來源於亞洲的、臨床上類似但病原為副粘病毒的新城疫，有人將前者稱為歐洲雞瘟或真性雞瘟，後者為亞洲雞瘟或偽雞瘟。水禽感染各種流感病毒，一般不表現臨床症狀，而在雞有的毒株可引起很高的死亡率(高致病性毒株)，有的則不引起死亡或很少死亡(低致病性毒株)。因此，高致病性禽流感實際上是指雞的疾病。唯恐人們將高致病性禽流感與禽流感等同起來，國際獸醫局遲遲不願取消“雞瘟”這個病名。目前在世界各地分離的禽類流感病毒己達千株以上，且在至少50種禽類中發現了流感病毒或其抗體，迄今所有的A型流感病毒的各種表面抗原，基本上都能在禽類流感病毒中找到。郭元吉等在我國17種不同野鳥中發現流感病毒的分佈也極為廣泛(1) (2) (3) (17)。

1997年香港發現首例感染人的H5N1禽流感病毒株，直到2003年2月, 先後在香港各區的雞場、市場雞檔、活雞批發市場等爆發的H5N1禽流感病毒感染而引起雞群大量死亡。但是其分離物在實驗室的鑒定中都是低致病性禽流感病毒。為什麼低致病性禽流感病毒能導致如此高的死亡率呢？本研究專門從協同致病作用入手，分析此種現象的原因。

1 材料與方法

1.1 材料

禽流感H5N1病毒株收集自香港各區多個雞場、雞場附近的排糞河道、香港米埔鳥類保護區、市場雞檔、活雞批發市場、動物園、醫院等。擴增各類家禽病毒基因片段的PCR引物由本實驗室研製及保存。分子生物學試劑、細菌藥敏檢測試劑、實驗動物、超靜台及其他分子病毒學、微生物學的實驗用具為本實驗室常規用品。細菌塵埃收集器為本實驗室自製產品。微生物與細胞體外同體培養裝置為本實驗室的專利發明。

1.1.2 WCK (Waisees Canine Kidney)細胞系為本實驗室培育的無潛伏病毒的犬腎細胞系。

1.2 方法

1.2.1. 病毒與細菌協同作用: 檢測禽流感病毒引物設計及其病毒的純化、病毒核酸的提取、PCR檢測及間接ELISA，菌種鑒定及菌種的抗生素抗性檢測參照文獻(6~17)的方法進行。並將PCR檢測結果為禽流感病毒陽性的原始病料作以下實驗。

1.2.1.1 鑒定併發細菌感染對病毒感染致病性影響的方法: 將禽流感病毒陽性的原始病料裏的細菌作菌體單克隆，再將有代表性單克隆細菌與禽流感病毒共同接種於以下條件的細胞培養物中，細胞培養參照文獻(15)的方法進行：

所述細菌接種於一與細胞隔離但通過孔徑不大於0.22微米微孔的濾膜與細胞培養物相通的培養室中，具體步驟為：

（1） 分別將細菌接種於固體LB培養皿中，37℃培養12小時，挑取單菌落並作菌種鑒定。

（2） 分別在42個克氏細胞培養瓶中用常規的細胞培養液1640培養WCK細胞系，待WCK 達 80% 融合時，接種待鑒定的20個禽流感病毒樣品；

A組： 將單克隆細菌分別接種於10個特製微型細菌培養室，再分別將10個細菌培養室放入已長有細胞的10個細胞培養瓶的培養液中，37℃培養12小時後取出細菌培養室， 繼續培養36小時。

B組： 分別接種10個禽流感病毒樣品入細胞培養瓶，于37℃培養48小時。

C組： 將分別接種了單克隆細菌的10個細菌培養室移入細胞培養瓶，于37℃培養12小時後取出細菌培養室， 繼續培養36小時。

D組： 10瓶不接種任何病原的細胞培養物作為對照組，繼續培養。觀察各組細胞培養瓶有無CPE出現。

1.2.2 細菌藥敏試驗參照文獻(18)的方法進行

1.3 判斷

根據在已接種低致病性禽流感病毒的細胞培養物出現CPE的情況，可得到以下的鑒定結果：

a. 如果只有接種類枯草桿菌的細胞培養瓶出現CPE，而接種類胰蛋白?的細菌的細胞培養瓶和對照組不出現CPE，表明此次檢測引起大量雞群死亡的流感病毒樣品是因類枯草桿菌的混合感染所造成的；

b. 如果只有接種類胰蛋白?的細菌的細胞培養瓶出現CPE，而接種類枯草桿菌的細胞培養瓶和對照組不出現CPE，表明此次檢測引起大量雞群死亡的流感病毒樣品是因類胰蛋白?的細菌的混合感染所造成的；

c. 如果接種類枯草桿菌及類胰蛋白?的細菌的細胞培養瓶都出現CPE，而對照組不出現CPE，表明此次檢測引起大量雞群死亡的流感病毒樣品，可以是因類枯草桿菌或類胰蛋白?的細菌混合感染所造成的；

d. 如果接種流感病毒的細胞培養瓶對照組出現CPE，表明此次檢測引起大量雞群死亡的流感病毒樣品是高致病流感病毒。

2. 結果

2.1

被檢測的菌種主要分為3大類：（1）為可產生類胰蛋白?的菌種。 （2）為可產生類枯草桿菌?的菌種。 （3）未知裂解?菌種（表格1）。

表格1
類胰蛋白?菌種
類枯草桿菌?菌種
未知裂解?菌種
抗生素敏感
菌種1
是
不敏感
菌種2
是
不敏感
菌種3
是
不敏感
菌種4
是
不敏感
菌種5
是
不敏感
菌種6
是
不敏感
菌種7
是
不敏感
菌種8
是
不敏感
菌種9
是
不敏感
菌種10
是
敏感
菌種11
是
敏感
菌種12
是
敏感
菌種13
是
敏感
菌種14
是
敏感
菌種15
是
敏感
菌種16
是
敏感
菌種17
是
敏感
菌種18
是
敏感
菌種19
是
敏感
菌種20
是
敏感
菌種21
是
敏感
菌種22
是
敏感
菌種23
是
敏感
菌種24
是
敏感
菌種25
是
敏感
菌種26
是
敏感
菌種27
是
敏感
菌種28
是
敏感
菌種29
是
敏感
菌種30
是
敏感
菌種31
是
敏感
菌種32
是
敏感
菌種33
是
敏感
菌種34
是
敏感
菌種35
是
敏感
菌種36
是
敏感
菌種37
是
敏感
菌種38
是
敏感
菌種39
是
敏感
菌種40
是
敏感
菌種41
是
敏感
菌種42
是
敏感
菌種43
是
敏感
菌種44
是
敏感
菌種45
是
敏感
菌種46
是
敏感
菌種47
是
不敏感
菌種48
是
不敏感
菌種49
是
不敏感
菌種50
是
敏感
菌種51
是
敏感
菌種52
是
敏感
菌種53
是
敏感
菌種54
是
敏感
菌種55
是
敏感
菌種56
是
敏感
菌種57
是
敏感
菌種58
是
敏感
菌種59
是
不敏感
菌種60
是
不敏感
菌種61
是
不敏感
菌種62
是
不敏感


2.2
類胰蛋白?的菌種及類枯草桿菌?的菌種中大部分對抗生素敏感。（表格2）

表格2


2.3 A組接種了禽流感病毒弱毒株的10個WCK細胞樣品在細菌培養室兩類菌種分別產生的類胰蛋白?及類枯草桿菌?的干擾下全部產生細胞病變。
B組只接種了禽流感病毒弱毒株的10個WCK細胞樣品不產生細胞病變。
C組只接種了單克隆細菌的10個WCK細胞樣品不產生細胞病變。
D組沒有接種任何病毒或細菌的10個WCK細胞樣品不產生細胞病變。

3. 討論

現今國際衛生組織分辨高、低致病性禽流感，現有技術主要採用以下方法：
(1)以1:10稀釋的含病毒的雞胚尿囊液靜脈注射0.2ML於8只6周齡的無特定病原(SPF)雞， 死亡率達到75%者為高致病性毒株。

(2)病毒接種于雞成纖維細胞(CEF)培養物，如產生細胞病變(CPE)，則毒株為高致病性。如果要預先用胰蛋白?處理細胞才能產生CPE，則病株為低致病性。

(3) H5和H7亞型按上述試驗鑒定為低致病性毒株則進一步進行禽流感病毒HA基因裂解位元點核?酸序列分析後，發現在裂點推斷的6個氨基酸序列是否與高致病性禽流感病毒一致( -6 到 -1 位點的性質最關鍵)。如果那裏只有2個或以下鹼性氨基酸，或雖有3個鹼性氨基酸但 -2 位點不是 一個 鹼性氨基酸，那就是低致病性毒株。如果 -4 至 -1位點全是鹼性氨基酸或雖 -2 位點不是 一個鹼性氨基酸但其他 5個是的話，則是高致病性毒株。代表性氨基酸排列如下:

-6 -5 -4 -3 -2 -1 G
高致病性 R K R K T R G
高致病性 K K K R G
低致病性 R E T R G
低致病性 R K T R G

注: (1) 鹼性氨基酸有三種: 賴氨酸 K，精氨酸 R，組氨酸 H

(2) T = 蘇氨酸、一種極性氨基酸

(3) G = 甘氨酸，一種非極性氨基酸

如病毒屬H5或H7血清亞型，而血凝素的裂解位點的氨基酸序列是KRRR/G毒株則為高致病性(19)。

上述現有技術的缺點是難於確定發生大量死亡雞群的死亡率是由感染的低致病性禽流
感病毒本身引起的，還是在併發細菌感染的協同作用下產生的。另外，因為大多數引起雞群大量死亡禽流感病毒，在實驗室的鑒定中都是低致病性禽流感病毒，所以在診斷上花費的時間較長。

目前我們實際觀察中發現雞群中存在的禽流感病毒主要屬低致病性毒株，但有時會發生高死亡率。

因此，即使實驗室證明分離株屬低致病性，也對雞群按高致病性流感那樣嚴格處理(如香港的殺雞事件)，因而對經濟和外貿造成很大的損失及背上長遠的負面地區形象。

自1997年香港發現首例感染人的H5N1禽流感病毒一直到2003年2月為止共發生20多宗的感染個案。

由於人群對新的流感病毒亞型的抗體缺乏, 從推理上應很快就形成流行病，而實際沒有形成流行病,這與普通臨床醫生喜歡使用廣譜抗生素有關。類胰蛋白?的菌種及類枯草桿菌?的菌種在廣譜抗生素的作用下得到抑制而不再產生類胰蛋白?及類枯草桿菌?，子代禽流感弱病毒的子病毒得不到類胰蛋白?及類枯草杆?的協同而終止複製。 從表格1及表格2指出有4個對抗生素不敏感的不知名裂解?菌種，但這些菌種所產生的裂解?卻可以列解血凝素列解位點，這將是很有價值的研究方向之一。

此次實驗中，A組及C組接種了有單克隆細菌的10個細菌培養室，然後再移入細胞培養瓶，於37℃培12小時後取出細菌培養室的目的是為了保證細菌培養室的細菌可分泌足夠的裂解?，但對細胞又不產生營養的爭奪。

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附錄: 細菌和細胞同體培養裝置

一種細胞體外同體培養裝置，其特徵是該裝置由細胞培養瓶1和細菌培養室3構成，細菌培養室置於細胞培養瓶中；該細菌培養室為一封閉結構，其壁上有一可與細胞培養瓶內的培養液相通的孔徑不大於0.22微米的微孔濾膜34。

按照專利要求4所述的裝置，其特徵是所述細菌培養室3是由a壁31與b壁32之間夾一密封圈33，並有若干固定螺絲35固定構成的封閉結構，其b壁上有開口36，該開口有一使細菌不能通過但其分泌的?和細胞培養瓶內的培養液可通過的孔徑不大於0.22微米的微孔濾膜34封閉。

按照專利要求5所述的裝置，其特徵是所述細菌培養室的a壁31、b壁32和固定螺絲35可用不銹鋼或無毒耐高溫塑膠加工製成，密封圈33可用無毒耐高溫橡膠或塑膠做成。提純後的病毒經套式PCR檢測（方法參照文獻2、5、6、7、8、9、10方法進行）。




電郵 / Email : waisees@hotmail.com